Biología (plan 1997) 2016-1

Quinto Semestre, Taller Nivel 1

Taller

“FISIOLOGIA DE CANALES IONICOS”

Profesores Participantes:

Dr. Arturo Hernández Cruz

Dr. Arturo Picones Medina

Dra. Arlet del Carmen Loza Huerta

Dr. Pedro Segura Charma

Fis. Cesar Oliver Lara Figueroa

Biol. Diana Millán Aldaco

ANTECEDENTES Y PERSPECTIVAS

El Laboratorio Nacional de Canalopatías (LNC) se ha creado como una unidad de investigación y servicio dentro del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM y apoyado financieramente por el CONACyT (Proy. Inv. ref. 260866). Originalmente inició sus operaciones en 2014 como la Unidad de Biofísica y Farmacología de Canales Iónicos, apoyada financieramente por la Secretaria de Ciencia, Tecnología e Innovación del DF (SECITI, convenio SECITI 039/2013) con el proyecto “Desarrollo de un Contraceptivo Masculino Basado en la Inhibición Especifica de los Canales Iónicos Catsper y Slo3 del Espermatozoide Humano.

El LNC además de contar con el equipo básico de un laboratorio especializado, tiene ya instalado y completamente funcional, instrumentación mayor en las áreas de citometría de flujo, fluorometría, y electrofisiología, estas dos últimas tanto multicanal y automatizadas, para el estudio y tamizaje de alto rendimiento de compuestos químicos con actividad fármaco-biológica sobre canales iónicos, convirtiéndose en el primer laboratorio de esta naturaleza en Latinoamérica.

En el Instituto de Fisiología Celular (IFC) de la UNAM se cuenta con una enorme diversidad de modelos experimentales, que van desde sistemas unicelulares hasta primates. Varios grupos de investigación en el IFC enfocan su trabajo científico estudiando la fisiología y biofísica de canales iónicos, registrando la actividad de este tipo de biomoléculas proteicas en células primarias y/o en líneas celulares. Con la introducción y adquisición del equipo automatizado como parte integral del LNC, se tiene la enorme ventaja de acelerar significativamente la producción de datos experimentales, electrofisiológicos y de fluorescencia, de la actividad de canales iónicos en al menos un orden de magnitud.

El LNC ofrece servicio a todos los investigadores del IFC interesados en trabajar con canales iónicos y dependiendo de la demanda, también apoyara el trabajo de investigadores de otras dependencias, como los Institutos de Investigaciones Biomédicas, Neurobiología, Biología, Química, Ciencias Genómicas, y las Facultades de Ciencias, Medicina y Química, entre otras de la UNAM, e incluso de otras instituciones académicas del país. Actualmente el LNC tiene tres Instituciones Asociadas, que son: el Instituto de Ciencias del Mar y Limnoología, el Instituto de Biotecnología, ambos de la UNAM, y el Instituto de Fisiología, de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.

En nuestro Laboratorio Nacional se propicia el desarrollo técnico, la innovación y la actualización de manera permanente en esta área del conocimiento científico y el avance tecnológico, en colaboración con las compañías especializadas en instrumentación en electrofisiología automatizada, las cuales se encuentran dispuestas a la interacción entre la industria de la instrumentación experimental y los centros universitarios de investigación. El LNC además participa activamente en la enseñanza, tanto en cursos especializados de licenciatura y posgrado, como ofreciendo cursos teórico-prácticos de entrenamiento.

Metodología

Búsqueda Masiva, Citometría de flujo y Ensayos alternativos de voltaje de membrana.

Con el tamizado masivo, esperamos encontrar decenas de compuestos con propiedades inhibitorias de los canales que nos permitan confirmar con el análisis más fino y detallado que el blanco es específicamente el canal en cuestión además de seleccionar aquellos que presenten las mejores características, como potencia, selectividad, baja toxicidad, etc. En la búsqueda fina confirmaremos que el blanco de los compuestos son los canales de nuestro interés y corroboraremos su actividad con ensayos fisiológicos en las funciones de los canales. Los compuestos seleccionados podrían desarrollarse con fines farmacéuticos, además tendrían las grandes ventajas de ser reversibles, no ser hormonales, y con un mínimo riesgo de efectos secundarios.

Registro de la Actividad de Canales Iónicos

Como ya se ha destacado, un aspecto fundamental de este proyecto es establecer la identidad molecular que explique los efectos observados, y la metodología experimental más directa para este objetivo es el registro electrofisiológico mediante la técnica de patch-clamp. Sin embargo, el número de compuestos orgánicos a explorar es muy grande, de ahí que también se prevé una cantidad elevada de compuestos con actividad biológica después de un tamizado masivo de alto rendimiento. Este tamizaje primario se lleva a cabo utilizando tecnología automatizada de fluorescencia, para lo cual se utiliza un instrumento lector de placas multimodal FlexStation 3, fabricado por Molecular Devices (Sunnyvale, California, USA), además con la capacidad de registrar Absorbancia, Luminiscencia y registros Cinéticos de Fluorescencia. En última instancia los compuestos químicos de molecula pequeña y polipeptídicos que resultasen detectados con actividad bio-farmacológica sobre los canales iónicos blancos, deberán ser probados electrofisiológicamente. Utilizando las técnicas convencionales de patch-clamp manual, se requeriría una inversión de esfuerzo y tiempo excesivos, por lo que se hará uso de las tecnologías de electrofisiología automatizada. Esta tecnología, de reciente aparición, hace posible elevar enormemente la capacidad de producción y análisis de datos experimentales. Es de esperarse que con esta técnica avancemos mucho más rápidamente en la identificación de posibles compuestos con actividad farmacológica sobre los canales. Para tal efecto, optimizaremos el registro directo de corrientes iónicas con el instrumento Sophion Q-Patch con 16 canales paralelos de registro automatizado de patch-clamp (ampliable a 48 canales en paralelo). De crucial importancia será lograr sellos de alta resistencia en células tan pequeñas como los espermatozoides de mamífero. Esto podrá ser posible mediante el uso de placas multi-pozos de patch-clam para el instrumento Q-Patch 16X con perforaciones de registro de diámetros menores a 2 micrómetros.

En los experimentos de electrofisiología, la composición iónica de la soluciones de pipeta y baño, el potencial de mantenimiento y los protocolos de voltaje se ajustarán de acuerdo al canal iónico en cuestión y el tipo de estudio necesario. Las corrientes eléctricas generadas por los canales en respuesta a pulsos de voltaje se adquirirán y analizarán empleando los programas digitales Clampex, Clampfit y Fetchan 10, instalados en computadoras personales (PC). La selectividad de las corrientes se determinará con protocolos de corrientes de cola y también rampas de voltaje para obtener el potencial reverso de estás empleando diferentes iones, dependiendo del canal.

PROGRAMA DEL NIVEL 1

OBJETIVOS GENERALES Y PARTICULARES:

El objetivo general del presente proyecto de Taller es el de capacitar estudiantes de la carrera de Biología de la Facultad de Ciencias en el estudio y análisis experimental de la actividad de proteínas de membrana formadoras de canales iónicos.

Al terminar el curso los alumnos deberán ser capaces de:

1. Entender los conceptos fundamentales que definen la estructura y función de los canales iónicos en tanto sus características generales, particularmente aquellos que se expresan en espermatozoides de vertebrados.

2. Formar parte integral de la organización de un laboratorio experimental

3. Efectuar las operaciones básicas necesarias para la formulación de soluciones fisiológicas para el registro de señales eléctricas en células aisladas.

PLAN DE TRABAJO: CONTENIDO TEMATICO

I. Modelos Matemáticos en la Física y la Biología. Conceptualización y Aplicaciones.

El Modelo Lineal. Deducción del Método de Regresión Lineal por Mínimos Cuadrados como un Ejercicio de Matemáticas.

II. Fenomenología Bioeléctrica

El Fenómeno de la Difusión. Leyes de Fick.

Conceptos Básicos de Circuitos Eléctricos.

Carga, Corriente, Voltaje, Resistencia/Conductancia. Ley de Ohm

Campo Eléctrico

Equivalente Eléctrico de Membrana Biológica.

Capacidad Eléctrica. Constante de Tiempo y Constante de Espacio.

Teoría Iónica de la Excitabilidad Celular.

Ecuación de Nernst y sus Extensiones

Bioelectricidad Molecular de Proteínas Formadoras de Canales Iónicos

Modelos Matemáticos en la Fenomenología Bioeléctrica.

III. Fisicoquímica de soluciones electrolíticas.

Concentración y actividad de iones en soluciones acuosas.

Acidez y Alcalinidad de soluciones acuosas: pH

Fenómenos Osmóticos y Osmolaridad

IV. Mantenimiento de Animales de Laboratorio

Cuidado y manejo de animales de laboratorio

Cuidado y manejo de erizos marinos

Obtención de tejidos y células por diseccion.

Obtención de celulas por medios químicos en erizos marinos.

EVALUACION DE LOS ALUMNOS PARTICIPANTES

1. Exámenes Conceptuales (50 % de la calificación final).
2. Participación en Seminarios del laboratorio (25% de la calificación final).
3. Desempeño del trabajo en el laboratorio (25% de la calificación final).

PROGRAMA DEL NIVEL 2

OBJETIVOS GENERALES Y PARTICULARES:

El objetivo general del presente proyecto de Taller es el de capacitar estudiantes de la carrera de Biología de la Facultad de Ciencias en el estudio y análisis experimental de la actividad de proteínas de membrana formadoras de canales iónicos.

Al terminar el curso 2 los alumnos deberán ser capaces de:

1. Entender los conceptos fundamentales de la Microscopia de Fluorescencia.

2. Determinar los cambios en calcio, pH y potencial de membrana en el Fluorómetro y el Citómetro de flujo.

3. Analizar imágenes de célula única y trazos en población.

PLAN DE TRABAJO: CONTENIDO TEMATICO

I. Microscopía de Fluorescencia.

Introducción a la Microscopía de Fluorescencia

Espectros de Excitación/Emisión y Fluoroforos

Detección de cambios en el calcio, pH y potencial de membrana plasmática en célula única

Análisis digital de imágenes (célula única)

II. Fluorómetro

Características y alcances del equipo

Detección de cambios de calcio

Detección de cambios de pH

Detección de cambios de potencial de membrana (Em)

III. Citómetro

Características y alcances del equipo

Detección de cambios de calcio

Detección de cambios de pH

Detección de cambios de potencial de membrana (Em)

IV. Análisis de datos de fluorescencia y citometría.

EVALUACION DE LOS ALUMNOS PARTICIPANTES

1. Exámenes Conceptuales (50 % de la calificación final).

2. Participación en Seminarios del laboratorio (25% de la calificación final).

3. Desempeño del trabajo en el laboratorio (25% de la calificación final).

PROGRAMA DEL NIVEL 3

OBJETIVOS GENERALES Y PARTICULARES:

El objetivo general del presente proyecto de Taller es el de capacitar estudiantes de la carrera de Biología de la Facultad de Ciencias en el estudio y análisis experimental de la actividad de proteínas de membrana formadoras de canales iónicos.

Al terminar el curso los alumnos deberán ser capaces de:

1. Diseñar protocolos para la determinación experimental en células vivas.

2. Evaluar y confirmar la existencia de fenómenos eléctricos mediante la técnica de Patch Clamp

3. Identificar las bases fisiológicas y biofísicas e implementar un modelo matemático capaz de describir estos fenómenos biológicos.

PLAN DE TRABAJO: CONTENIDO TEMATICO

I. Introducción al desarrollo Experimental

Micromanipulación.

Cultivo Celular

Patch Clamp.

II. Desarrollo experimental.

Registro celular.

Fijación de voltaje.

Registro de Célula completa.

Protocolos.

III. Mecanismo y Cinética de Canales iónicos

Selectividad iónica

IV. Modelos Matemáticos.

EVALUACION DE LOS ALUMNOS PARTICIPANTES

1. Exámenes Conceptuales (25 % de la calificación final).

2. Participación en Seminarios del laboratorio (25% de la calificación final).

3. Desempeño del trabajo en el laboratorio (50% de la calificación final).

PROGRAMA DEL NIVEL 4

OBJETIVOS GENERALES Y PARTICULARES:

El objetivo general del presente proyecto de Taller es el de capacitar estudiantes de la carrera de Biología de la Facultad de Ciencias en el estudio y análisis experimental de la actividad de proteínas de membrana formadoras de canales iónicos.

Al terminar el curso los alumnos deberán ser capaces de:

1. Entender los conceptos fundamentales de la tecnología empleada en la instrumentación de patch-clamp automatizado.

2. Diseñar protocolos para la determinación experimental de corrientes iónicas membranales mediante patch-clamp automatizado.

3. Ejecutar las metodologías empleadas en el cultivo de líneas celulares utilizadas como sistemas heterólogos de expresión de canales iónicos, las cuales serán registradas con instrumentación de patch-clamp automatizado.

4. Llevar a cabo determinaciones experimentales registrando corrientes iónicas generadas por canales iónicos expresados en líneas celulares mediante instrumentación de patch-clamp automatizado.

PLAN DE TRABAJO: CONTENIDO TEMATICO

1. Metodología Experimental para el Análisis Automatizado.

1. Bioensayos Funcionales de Sistemas Celulares
2. Automatización. Miniaturización. Alto Rendimiento

2. La Técnica de Electrofisiología Automatizada de Canales Iónicos

1. Patch-clamp “plano”
2. Alto rendimiento del registro y el procesamiento de datos electrofisiológicos.
3. Análisis comparativo respecto del patch-clamp clásico.

3. Aproximación Biotecnológica

1. Los canales iónicos como blancos terapéuticos.

EVALUACION DE LOS ALUMNOS PARTICIPANTES

1. Exámenes Conceptuales (25 % de la calificación final).
2. Participación en Seminarios del laboratorio (25% de la calificación final).
3. Desempeño del trabajo en el laboratorio (50% de la calificación final).

REQUERIMIENTOS FÍSICOS DEL TALLER

Para el correcto desarrollo del Taller, se cuenta con un salón de seminarios donde se impartirán las clases teóricas, así como, las discusiones de grupo. Se cuenta con un laboratorio totalmente equipado para realizar las sesiones prácticas, además de un espacio exclusivo para estudiantes.

ÁREAS Y TEMAS PARA LA ELABORACIÓN DE TESIS DE LICENCIATURA

Biofísica.

Bioquímica.

Electrofisiología.

Farmacología.

Fisiología.