Presentación del grupo 5183 - 2012-1.

TEMARIO DEL CURSO OPTATIVO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

(GENES Y GENOMAS / 2012)

PROFESOR:DR. VÍCTOR VALDÉS-LÓPEZ

CONCEPTOS, PARADIGMAS Y PARADOJAS.SINGULARIDADES Y GENERALIDADES

1.- INTRODUCCIÓN. (Estructura y función de proteínas y ácidos nucleicos). Origen y génesis de la biología molecular. La escuela estructural y la escuela informacional: planteamiento de las preguntas básicas y sus alcances conceptuales. Estrategias de secuenciación. ¿Por qué primer? ¿Por qué timina? Uracilo vs. Timina. Los 20 mágicos. Análisis de la composición de aminoácidos. Aminoácidos abundantes y no abundantes en la composición de una proteína globular promedio. Estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de proteínas (ejemplos específicos de la relación estructura función en proteínas modelo). Concepto de dominio polipeptídico. Concepto de conformación nativa. Factores y fuerzas que contribuyen a la estabilización de la estructura tridimensional (interacciones débiles no-covalentes; puentes de hidrógeno; el colapso hidrofóbico.) Diferencias y similitudes entre proteínas de organismos mesófilos y termófilos. La paradoja de los enlaces disulfuro. Factores que determinan la conformación nativa. Los experimentos y el paradigmade Anfinsen. Desnaturalización y renaturalización.Importancia del peso molecular y el macromolecular crowding. Plegamiento co-traduccional. La paradoja de Levinthal. ¿Existen rutas preferenciales de plegamiento? Introducción de los conceptos de patología molecular por plegamiento erróneo y de asistentes de plegamiento. Generalizaciones y ejemplos puntuales: Neuropatologías espongiformes causadas por priones (tecnologías de DNA recombinante – bibliotecas, vectores, electroforesis, Southern, northern, westwrn, microarreglos, SAGE); información en la cadena polipeptídica vs. chaperonas moleculares. ¿Cuál es la magnitud de la complejidad informacional a nivel molecular? i. e. ¿Cuál es el número total de genes que han ocurrido en la historia de la vida? Alineamientos pareados. Alineamientos múltiples. Residuos invariantes, variantes e hipervariables. Regiones conservadas. Perfiles de hidrofobicidad. La utilidad de una secuencia consenso. Predicciones de estructura secundaria. Dendrogramas. Predicción de secuencias ancestrales. Familias multigénicas (1,000 familias para el biólogo molecular). El prevalente principio de la recurrencia repetitiva. Simulaciones de plegamiento in silico; coincidencias y concordancias con los modelos in vivo.

Antecedentes experimentales del modelo de Watson y Crick: Avery/McLeod/McCarty (el principio transformante), Hershey/Chase (el experimento de la licuadora) y Chargaff (la relación de simetría y la relación de asimetría). Encuentro de las escuelas estructural e informacional en el modelo. Perspectiva e implicaciones biológicas del modelo de la doble hélice. La colinearidad del gen y su producto polipeptídico. El Dogma Central de la Biología Molecular. Los flujos prohibidos, generales y particulares. Bases, nucleótidos y polinucleótidos. DNA y RNA. Polaridad de la cadena polinucleotídica. Antiparalelismo. El surco mayor y el surco menor. Estabilización por hidratación. Super-enrollamiento del DNA. Densidad de flotación, desnaturalización y efecto hipercrómico. ¿Por qué el DNA nativo no forma cristales? Fluctuaciones de los parámetros helicoidales dependientes de secuencia. Importancia informacional de las variaciones topológicas del DNA. Definición de información extrínseca (codificante) e intrínseca (regulatoria) de los ácidos nucleicos. Información estructural del DNA, tRNA, rRNA y mRNA.

2.- ESTRATEGIAS EVOLUTIVAS A NIVEL MOLECULAR. Características y organización del código genético. Interpretaciones biológicas de la universalidad del código. Familias de codones mono y heterocodificantes. Las simetrías del código. La tercera base de los codones ¿es la menos importante o la más importante? Consecuencias informacionales de las mutaciones puntuales como un factor de selección natural sobre la evolución del código genético. Utilización preferencial de codones: dialectos del código como un mecanismo de regulación de la expresión génica. Inferencias evolutivas de los códigos mitocondriales. Evolución de la estructura primaria y de la estructura tridimensional de proteínas. Importancia de los aportes de la biología molecular al paradigma darwiniano. Ejemplos puntuales de filogenias moleculares. Derivación del concepto de homología (genes parálogos y ortólogos). Perspectiva de la biodiversidad a nivel molecular. Impacto de la Biología Molecular en sistemática, taxonomía y evolución. Velocidad de cambio de las secuencias de macromoléculas (el reloj evolutivo y la teoría neutral). Alternativas evolutivas a nivel molecular (el recate del paradigma darwiniano): Las globinas (mioglobina y hemoglobina) y FOXP2, como un sistema modelo: mutaciones adaptativas, duplicación génica (genes parálogos y genes ortólogos), impacto de las mutaciones regulatorias (diferencias morfológicas vs. moleculares chimpancé / humano ¿Por qué no somos chimpancés?

3.- GENES Y GENOMAS. Relación entre el tamaño del genoma y la complejidad morfológica. La paradoja del valor C. Tamaño del genoma vs. número de genes. Discrepancia entre el tamaño del genoma y el número de genes. Definiendo y delimitando al gen: Tamaño y ubicación de los marcos de lectura abiertos (ORFs). El Índice de Adaptación de Codones (CAI); distribución asimétrica de purinas y pirimidinas. Genomas de tipo procarionte (bacteriofagos, - jx174, secuenciación y características, bacterias y arqueas). Concepto de capacidad génica Mega-proyectos de secuenciación de genomas completos. Perspectiva global del metabolismo celular a partir del genoma. ¿Nos falta por conocer el 50% de las funciones celulares? Comparación global de genomas: genes ancestrales y genes específicos. Tamaño promedio del gen procarionte. Sintenia. Complemento genético mínimo: ¿Vida con 500 genes? Avances recientes en los proyectos de secuenciación de genomas eucariontes: Levaduras, gusanos, moscas, gallos, ratones, chimpancés, plantas y humanos. Experimentos de hibridación de ácidos nucleicos / gráficas de Cot. Genes comunes (housekeeping), y genes de diferenciación. Tipos y clases de secuencias en el genoma eucarionte. Secuencias altamente repetitivas, moderadamente repetitivas y no repetitivas: (DNA satélite, centrómeros, telómeros, genes anidados, familias repetitivas de secuencias interdispersas (LINE, SINE), retrotranscritos, genes amplificados, DNA espaciador, reiteración génica, tamaño y característica medias de los genes eucariontes, longitud del mRNA citoplasmático maduro, genes de susceptibilidad a enfermedades, natura vs. nutura, medicina genómica, farmacogenómica. Pseudogenes (El decaimiento masivo del sub-genoma olfativo / Miosina 16 y la reducción de la masticación – menos es más). BLAST. El lado oscuro del genoma humano, retropseudogenes, genes procesados).

BACKGROUND

LOS FLUJOS DE INFORMACIÓN

4.- REPLICACIÓN. Proteínas cromosomales histonas y no-histonas. El omnipresente nucleosoma. DNA extracromosómico (mitocondrias y cloroplastos). Regulación del replicón. La lógica de los ciclos celulares. El sitio de origen. El sitio de término. Replicación bidireccional.Características y requisitos de las DNA. polimerasas y su capacidad de autocorreción. Replicación semidiscontinua. El papel de la síntesis de RNA en la replicación. Los fragmentos de Okazaki. Elementos del aparato replicativo: proteínas destorcedoras, desestabilizadoras y desenrrolladoras. Corrección de la incorporación errónea de dUTP por la DNA polimerasa. Consecuencias informacionales de la desaminación oxidativa de las citosinas en el DNA y en el RNA.Particularidades y similitudes en procariontes y eucariontes.

5.- TRANSCRIPCIÓN. Concepto de regulación diferencial de la expresión génica. Definición de Unidad de Transcripción. Transcripción en procariontes:La RNA polimerasa de E coli; transcritos policistrónicos; acoplamiento entre transcripción, traducción y degradación del mRNA; sigma (?) y el reconocimiento del sitio de inicio; organización del promotor; delimitación de secuencias (río arriba y río abajo); concepto de secuencias consenso o canónicas; orquestación de la expresión génica; mutaciones en el promotor como un paradigma del efecto de variaciones en las secuencias regulatorias; características del terminador; mecanismo de acción de rho (?); organización del mensajero (secuencias transcritas no traducidas: el líder y el trailer), el sitio de reconocimiento al ribosoma (secuencia de Shine-Dalgarno); importancia de la estructura tridimensional del transcrito. Transcripción en eucariontes: Las RNA polimerasas eucariontes. Clases de unidades de transcripción. Transcripción de los genes pequeños y de la unidad de transcripción de rRNA 18-28S. Estructura canónica del gen eucarionte (RNA Pol II) ; el problema del terminador eucarionte; el promotor multipartito eucarionte (cajas, factores de transcripción, control remoto, “enhancers”); HnRNA; procesamiento postranscripcional (CAP, PoliA, empalme); generalidades y particularidades de los genes partidos; remoción de intrones y empalme de exones; origen, evolución y función del gen fragmentado (hipótesis Gilbert-Blake del minigen), dominios informacionales-estructurales; el universo de exones. El mRNA maduro. Papel de las regiones 5' y 3' no traducidas. Iron Control Element. Edición de mRNA’s.

6.- TRADUCCIÓN. Los elementos del aparato de traducción. Estructura de los tRNA's. Especificidad de las aminoacil-tRNA sintetasas. Reacción de activación de los aminoácidos al transfer, (termodinámica de la reacción). Autocorreción. Transfers isoaceptores y supresores. Nucleótidos críticos en el reconocimiento de los transfers. Los ribosomas: las proteínas y los RNA's ribosomales (estructura y función). Estructura tridimensional del ribosoma. La iniciación, la elongación (transpeptidación y translocación), la terminación. El papel de la hidrólisis de GTP. Factores. Procesamiento postraduccional de polipéptidos. La selenocisteina: el aminoácido 21.

OTROS ASPECTOS DE LA REGULACIÓN DELA EXPRESIÓN GÉNICA

7.- BACTERIAS Y BACTERIOFAGOS. Un sistema Integrador de la regulación a nivel de transcripción y traducción: ? X174. Genes sobrelapados, regiones intercistronicas, la ubicación del promotor y el terminador.

Enzimas constitutivas y enzimas adaptativas. El paradigma del operón Lac. Estructura tridimensional del represor. Los tres operadores Lac. Control sin represor: el mecanismo de atenuación (el operón Trp y el operón His). Los operones de lambda. Controles en la vía lítica y controles en la vía lisogénica.

8.- EUCARIONTES. Transplantes nucleares (ayer y hoy). La ley de la constancia del genoma. Genes de diferenciación y genes de rutina. Expresión tejido específica y expresión común. Mensajeros abundantes y mensajeros escasos. Características del gen activo en transcripción eucarionte: análisis por DNAsa I; cambios conformacionales y sensibilidad preferencial; genes con alto y bajo nivel de transcripción; propagación del cambio conformacional; patrón de metilación y submetilación; papel de las proteínas cromosomales no-histonas; sitios hipersensibles; sub-niveles de activación. La jerarquía del desarrollo ontogenético: genes maternos, genes de segmentación y genes homeóticos. El homeo-box y el dominio homeótico; homologías con otros polipéptidos regulatorios; ubicación espacio-temporal del patrón de expresión de genes específicos. El papel del gen Pax-6 en la morfogénesis del ojo.

TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE

9.- ACTIVIDADES ENZIMATICAS SOBRE EL DNA. Restricción y metilación del DNA. Endonucleasas de restricción. Ligación (extremos cohesivos/extremos rasurados). DNA polimerasas. RNA polimerasas. Cinasas. Fosfatasas. Nucleasas.

10.- ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Geles de agarosa. Buffers, tinción. Electroforesis de plásmidos, RNA y DNA genómico. RFLPs. Electroforesis de pulsos. Geles de poliacrilamida.

11.- CONCEPTO Y MANEJO DE LIBRERÍAS. Librerías de cDNA. Librerías genómicas. Estrategias y metodologías de construcción de librerías de cDNA y genómicas.

12.- VECTORES USADOS EN LA CLONACION MOLECULAR.Características y desarrollo de plásmidos como vectores. Plásmidos comúnmente usados. Estrategias de clonación. Preparación de células competentes de Escherichia coli. Transformación e identificación de colonias bacterianas que contienen plásmidos recombinantes. Biología molecular del fago l. Vectores derivados de fagos. Estrategias de clonación utilizando el fago l. Vectores derivados de bacteriofagos de cadena sencilla. Fagémidos y fásmidos. Cósmidos. YACS (Yeast Artificial Chromosomes). Características de vectores de clonación en eucariontes. Animales transgénicos. El gen Per y el gen Ob.

13.- ESTRATEGIAS DE CLONACION MOLECULAR EN PLANTAS. Metodologías de transformación (Agrobacterium, electroporación y bio-balística).Genes reporteros. Resistencia a insectos. Plantas resistentes a herbicidas y patógenos. Biocontrol de metales pesados. Vacunas orales en plantas.

14.- DETECCIÓN ANÁLISIS Y MANIPULACIÓN DE GENES CLONADOS.Tamizado de librerías de expresión con anticuerpos. Hibridación de ácidos nucleicos. Tamizado de librerías con oligonucleótidos y sondas radioactivas. Gene trapper. Transferencia e hibridación de tipo Southern y northern.

15.- SECUENCIACIÓN DEL DNA. Estrategias y técnicas de secuenciación. El método de terminación de la cadena mediada por la incorporación de dideoxirribonucleótidos. Análisis de la secuencia. Métodos para determinar el marco de lectura abierto (ORF). Obtención y análisis de la secuencia derivada de aminoácidos. Obtención y uso del patrón de restricción. Comparación de las secuencias derivadas con bancos de secuencias. Determinación de interrelaciones evolutivas. Genealogías y filogénias. Concepto dehomología, (genes parálogos y genes ortólogos). Análisis de DNA antiguo. Evolución a nivel molecular.

16.- METODOLOGÍA Y ESTRATEGIAS ESPECIALES.Amplificación in vitro de DNA por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mutagénesis sitio dirigida. Remplazo génico. Tecnología del RNA antisentido (jitomates con maduración retardada). Expressed Sequence Tags (ESTs). Monitoreo cuantitativo de patrones de expresión génica con microarreglos de DNA complementario. Análisis serial de la expresión génica (SAGE): hacia la definición del transcriptoma.

R E F E R E N C I A S

·Lewin, B.: Genes VII. OxfordUniversity Press. New York, 2000.

·Lewin, B.: Genes ON LINE: www.ergito.com

·Judson, H. F.: The Eighth Day of Creation. The Makers of the Revolution in Biology. Simon&Schuster, New York, 1979.

·Judson, H. F.: The Eighth Day of Creation. The Makers of the Revolution in Biology. Expanded Edition. ColdSpringHarbor Laboratory Press. New York. 1996.

·Origins of Molecular Biology. A Tribute to Jacques Monod. Lwoff, A., and Ullmann, A Eds. Academic Press. New York, 1979.

·Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T.: Molecular Cloning. ALaboratory Manual. 2nd Ed.ColdSpringHarbor Laboratory Press, 1989.

·Monod, J.: Chance and Necessity: An essay on the natural philosophy of modern biology. Wainhouse, Anstryn (trans.). Vintage Books, Random House, 1971.

·Darwin, C.: The Origin of Species: By means of natural selection or the preservation of favoured races in the struggle for life. Mentor Book from New American Library. New York, 1872.

·Jacob, F.:La Logique du Vivant. Une historie de l’hérédité. Éditions Gallimard. Paris, 1970.

·Watson, J. D.: The Double Helix. Atheneum, New York, 1980.

·Molecular Evolution: Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid Sequences. Doolittle, R. F., Ed. Methods in Enzymology, Vol 183. Academic Press, Inc. San Diego, 1990.

·Doolittle, R. F.: Of URFS and ORFS. A Primer on How to Analyze Derived Amino Acid Sequences. University Science Books. Mill Valley, CA, 1986.

·Committee on Mapping and Sequencing the Human Genome. Board on Basic Biology. Commission on Life Sciences. National Research Council.: Mapping and Sequencing the Human Genome. NationalAcademy Press. Washington, D.C., 1988.

·Bains, W.: Genetic Engineering for Almost Everybody. Penguin Books. London, 1987.

·Valdés López, V., Vilchis Peluyera A. y Alba Lois L.: Paisajes Genómicos. Capítulo II. En: Lo que somos y el genoma humano. Des-velando nuestra identidad. Ediciones Científicas Universitarias (ISBN 970-32-1663-3) y Fondo de Cultura Económica (ISBN 968-16-7321-2). Antonio Velázquez Arellano, Coordinador. Pp., 31 – 49, 2004.

·Valdés López, Víctor.: Biología Molecular, Evolución y Genómica (Cap. 30; pp 215 - 235). En “Aprendizaje de la parasitología basado en problemas” Coordinadores Ana Flisser Steinbruch y Ruy Pérez Tamayo. Editores de Textos Mexicanos (ETM). ISBN 968 – 5610 – 43 – 6. (2006).

·Valdés López, Víctor.: Problemas de Biología molecular (Cap. 3; pp 15 – 19). En “Aprendizaje de la parasitología basado en problemas” Coordinadores Ana Flisser Steinbruch y Ruy Pérez Tamayo. Editores de Textos Mexicanos (ETM). ISBN 968 – 5610 – 43 – 6. 2006.